.RU

В. П. Ердакова теоретические и практические - страница 17


Кроме того, липосомы широко используют в качестве модельных систем при изучении принципов молекулярной организации и механизмов функционирования биологических мембран. Они пригодны для изучения пассивного транспорта ионов и малых молекул через липидный бислой. Изменяя состав липидов в липосоме, можно направленно менять свойства мембран. Включением мембранных белков в липидный бислой получают так называемые протеолипосомы, которые используют для моделирования разнообразных ферментативных, транспортных и рецепторных функций клеточных мембран. Липосомы используют также в иммунологических исследованиях, вводя в них различные антигены или ковалентно присоединяя к липосомам антитела. Они представляют собой удобную модель для изучения действия на мембраны многих лекарственных средств и других биологически активных веществ. Во внутренний водный объем липосом (в том числе полимерных) можно включать лекарства, пептиды, белки и нуклеиновые кислоты, что создает возможность практического применения липосом в качестве средства доставки разных веществ в определенные органы и ткани.
Многочисленные исследования, проведенные уже не биологами, а химиками, показали, что липосомоподобные везикулы могут быть получены из большого числа самых разных органических веществ при условии, что их молекулы построены в соответствии с принципом амфифильности, то есть содержат группировки, обладающие сродством к воде, и области, имеющие гидрофобный характер [217–219].

Такие синтетические везикулы, как и настоящие липосомы, сохраняют все свойства оболочечных структур, включая их морфологическое разнообразие, и во многих случаях могут прекрасно заменять липосомы, сделанные из природных материалов. Этот факт показывает, что везикулярные структуры имеют гораздо более широкое распространение, чем ранее предполагалось. Более того, соблюдение принципа амфифильности позволяет получать везикулы не только в воде, но и в неполярных органических растворителях (рисунок 3.14).


Рисунок 3.14 – Везикулы, образуемые синтетическими
амфифилами в растворителях разной полярности


Сложные эфиры сахарозы и лауриновой кислоты образуют нормальные везикулы при диспергировании в воде, а в изооктане дают обращенные везикулы, когда углеводородные цепи находятся на поверхности везикулы, а полярные головки образуют внутреннюю область бислоя. В случае фторсодержащих амфифилов введение в молекулу двух достаточно длинных фторуглеродных цепей придает ей сольвофобность по отношению к таким неполярным растворителям, как циклогексан и бензол, поскольку фторуглероды плохо растворяются в этих растворителях. Такие молекулы в неполярных растворителях формируют бислой, при замыкании которого образуются везикулы.

Еще более удивительным представляется образование бислойных везикул из молекул, вообще не содержащих гидрофильных полярных головок (см. рисунок 3.14). Этот случай демонстрирует более общий принцип амфифильности, определяемый как сочетание в молекуле сольвофильных и сольвофобных свойств, т.е. сродства и «нелюбви» к растворителю. Все это говорит о том, что мембранный принцип организации материи распространяется не только на живые объекты, но и на неживой мир [115].
Химики используют липосомы, например, для защиты катализаторов. Получены очень устойчивые золотые и платиновые катализаторы, которые представляют собой липосомы, заполненные коллоидными растворами металла. Другими примерами активного применения липосом могут быть: удобрения, заключенные в модифицированную полимерами липосомальную оболочку, применение которых значительно уменьшает расход этих элементов питания растений; пролонгированные формы феромонов, используемые в ловушках для вредных насекомых; полимерные противообрастающие покрытия, используемые для покраски днищ судов.
Промышленность в огромных количествах сбрасывает в воду и воздух токсичные тяжёлые металлы. Попадая в человеческий организм, они накапливаются и вызывают тяжёлые отравления, необратимые генетические нарушения. Удалить их из тканей нелегко, и здесь хорошую службу могут сослужить хелаты – соединения-комплексообразователи, способные связывать ионы тяжёлых металлов. Но хелаты с трудом преодолевают клеточную мембрану. Американскому ученому Раману удалось ввести их в клетки с помощью липосом [195].

Приведенные примеры показывают, что липосомы уже переходят в разряд продуктов крупномасштабного производства, требующего высокопроизводительного оборудования и ориентированного на дешевое и доступное сырье. Ясно, что такое производство не может быть построено на основе природных фосфолипидов, выделяемых, как правило, из растительного сырья. Решение проблемы состоит в использовании для этих целей не самих липосом, а искусственных везикул, изготавливаемых из синтетических амфифильных соединений.

^ 3.7 Тенденции применения растительных масел
в производстве липидной космецевтической продукции


В настоящее время активно пропагандируется ограничение жиров в рационе. Автоматически в сознании потребителя это переносится на косметические средства, что способствует росту популярности не жировой косметики (гели, кремы на силиконовой основе). На самом деле как в питании, так и в косметике вреден не всякий жир, а избыток насыщенных (твердых) жиров. При этом есть жиры, в которых кожа нуждается, и жиры, которые обязательно должны быть включены в рецептуры косметических препаратов, так как они содержат в своем составе жизненно важные для организма компоненты.

Применение в космецевтических препаратах находят как полиненасыщенные, жидкие масла, так и твердые, полутвердые масла, а также их гидрогенизаты и продукты их переэтерификации. Они применяются в качестве питающих, защитных, транспортных липидных, биоактивных ингредиентов косметических эмульсий, губных помад, масел для детей и принятия ванн, массажных, антицеллюлитных, солнцезащитных препаратов, пережиривающих добавок в гигиенических  моющих средствах. Такие масла, как касторовое, миндальное, оливковое, подсолнечное, авокадо и другие, непосредственно используются в качестве эмолентов. Масла, с высоким содержанием лауриновой кислоты (кокосовое), широко используются в производстве кускового мыла и ПАВ. Масла используют и в качестве биологически активных субстанций (Woollatt E. The Manufacturof Soap, 1985).

Липофильная часть многих амфифильных ингредиентов базируется на растительных маслах. Растительные масла служат сырьевым источником фосфатидов, токоферолов, фитостеринов. Некоторые, как, например, масло виноградных семян и масла из зародышей злаковых, уникальны, так как являются источником благотворно действующих на кожу природных антиоксидантов, фитостеринов, жирных ненасыщенных кислот. Эти вещества дефицитны в кожном жире, особенно у пожилых людей, и их роль в замедлении процессов старения и осуществлении барьерной функции кожи необычайно велика.

Масла бурачника и черной смородины содержат значительные количества линолевой кислоты, масло облепихи содержит фитостерины, токоферолы, сквалеин, полифенолы и другие соединения с регенерирующей, защитной, антиоксидантной и влагоудерживающей функциями (Марголина А.А. и др., 2002).

Линолевая и линоленовая кислоты, содержащиеся в растительном масле, – единственно истинно экзогенные, незаменимые жирные кислоты, так как они не синтезируются в организме и должны поступать извне (Kantor H.L., 1978). В ходе нескольких ферментативных реакций они превращаются в жирные ненасыщенные кислоты с более длинными углеводородными цепями, а также в тканевые «гормоны» – эйкозаноиды, участвующие в жизнедеятельности организма.

Действие на кожу незаменимых жирных кислот представлено двумя механизмами. Во-первых, эти кислоты, как и все липиды, могут прямо влиять на структуру межклеточного связующего вещества рогового слоя. А во-вторых, они обладают биологической активностью за счет метаболитов (Аркт Я., 2001). В различных маслах содержится неодинаковое количество жирных кислот.

Хорошо известно, что дефицит незаменимых жирных кислот приводит к нарушению барьерной функции кожи. Восстановить кожный барьер можно путем местного нанесения полиненасыщенных жирных кислот [145]. Такие серьезные болезни, как псориаз и некоторые формы атопического дерматита, возникают на фоне дефицита фермента Δ-6-десатуразы, которая превращает линолевую кислоту в γ-линоленовую кислоту. Эта проблема может быть устранена местным применением масел с высоким содержанием γ-линоленовой кислоты. В литературе описан благотворный эффект пищевых добавок, содержащих незаменимые ω-3 жирные кислоты. α-Линоленовая кислота обладает противовоспалительным и осветляющим действием.

Сложность состава природного растительного масла требует сочетания нескольких методов исследования, основанных на различных физических и химических принципах (Верещагин А., 1972). Этими методами чаще всего определяют йодное число, число омыления, кислотное число, эфирное число, а также химические константы: число Генера, число Рейхер-Мейсля, число Поленске и другие исследования (Ржехина В., 1967). Физическими методами определяется температура плавления, температура застывания, растворимость и некоторые другие показатели растительных масел.

Газохроматографические методы определения жирно-кислотного состава масел проводят согласно требованиям ГОСТ 30418-96 «Масла растительные. Метод определения жирно-кислотного состава» и
ГОСТ 51483-99 «Масла растительные и животные жиры. Определение методом газовой хроматографии массовой доли метиловых эфиров индивидуальных жирных кислот к их сумме». Существуют также методики, не указанные в стандартах, при помощи которых возможно определение состава жирных кислот. Так, хроматография в тонком слое адсорбента эффективна при изучении липидов (Шоль Э., 1965), а метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) на носителях, содержащих ион серебра, используется для идентификации неизвестных кислот. Он основан на разделении кислот на одинаковые группы по степени ненасыщенности и геометрической конфигурации. Возможность использования колоночной хроматографии для фракционного разделения соевого и рапсового масел доказана в работе Hayashi (1993).

Популярностью в настоящее время пользуется применение комбинированных методов анализа растительных масел. Встречаются методики, посвященные разделению и идентификации жирных природных кислот, сочетающие газожидкостную хроматографию (ГЖХ), капиллярную ГЖХ и жидкостную хроматографию высокого давления на обращенных фазах (Blanch С., 1998), обратнофазовую жидкостную хроматографию высокого давления и масс-спектрометрию (Neff, 2001), а также УФ-спектроскопию.

Оптимизация методов определения перекисного окисления липидов является одной из актуальных задач.


4 Конструирование трансдермальных

липосомальных препаратов


^ 4.1 Проблемы применения и хранения липосом


Одной из основных проблем, связанных с липосомальными препаратами, является их стабильность в условиях длительного хранения.

Следует принять во внимание и химическую нестабильность отдельных липосомальных компонентов, особенно если для построения липосом использовались ненасыщенные фосфолипиды (Ashady R., 1999). В этом случае может произойти окисление двойных связей или гидролиз эфирных связей. Однако поскольку сегодня выбор материала для мембраны липосом обширен, эту проблему можно решить, используя гидрогенизированные фосфолипиды. Водное окружение липосомальных продуктов также влечет теоретический риск гидролиза. Однако при водородном показателе рН, находящемся в пределах
4,5–6,5, это разложение с образованием лизофосфолипидов и чистых жирных кислот можно фактически проигнорировать.

Липосомы могут быть разрушены сдвиговыми силами, действующими в процессе производства конечного продукта. Утечка инкапсулированного материала из сердцевины липосомы – это другая проблема, зависящая в большей степени от рецептурных тонкостей и технологий приготовления (Kettenes – Vanden Bosh J.J., 2000). Кроме того, липосомы имеют ограниченную стабильность, связанную с агрегацией наночастиц и потерей активного компонента во внешнюю среду или химической деградацией активного компонента. Физическая стабильность липосом определяется типом используемых полярных липидов, т.е. их головными группами и природой жирных кислот. Отрицательно заряженные фосфолипиды повышают плотность распределения заряда на поверхности мембраны и, следовательно, снижают риск слияния. Полярные липиды с насыщенными жирными кислотами образуют мембраны, которые при комнатной температуре обладают гелевой структурой в отличие от жидкокристаллической структуры ненасыщенных полярных липидов. Мембраны в гелеобразном состоянии обладают лучшими герметизирующими свойствами, благодаря чему капсулированное активное вещество удерживается внутри липосомы в течение длительного времени.


^ 4.2 Пути повышения стабильности липосомальных

препаратов


Итак, ключевыми целями при получении липосомальных препаратов являются сохранение липосом в конечном составе и поддержание их эффективности. В соответствии с этим должны быть учтены три различных аспекта:

- практические ограничения липосомных систем;

- проблемы, связанные с их долгосрочным хранением;

- проблемы, непосредственно связанные с капсулированием.

^ Практические ограничения липосомальных препаратов могут быть связаны с величиной захватываемого объема, как будет отмечено ниже, возможность максимизировать эту величину регулируется выбором типа липосом и липидного содержания. Липосомам свойственно протекать, что приводит к преждевременному высвобождению активного компонента из липосомы, следовательно, воздействие активного компонента ограничивается только роговым слоем и делает его недоступным для внутренних слоев кожи. Кроме того, это может приводить к преждевременному или нежелательному взаимодействию активного вещества с другими компонентами косметического средства. Важно иметь это в виду при определении сроков хранения продукта. На практике уровень захвата, уместный для потребителя, – это уровень во время использования, а не во время производства.

При включении активных веществ (экстрактов) в липосомы необходимо учитывать, что спирт, пропиленгликоль и глицерин разрушают липосомы, если их концентрация в конечной липосомальной дисперсии превышает 5 % от содержания в ней фосфолипидов (или липосом). Включение в липосомы жирорастворимых веществ возможно при условии, что их количество будет составлять не более 2 % от содержания фосфолипидов (или липосом) [220].

В период хранения липосомальных средств возникают две основные проблемы – окислительная и микробиологическая порча.

Окислительная порча возможна, прежде всего, из-за перекисного окисления липидов. Перекисное окисление липидов является важным показателем, определяющим качество липидных препаратов.

Перекисное окисление липидов – это окисление жирных ненасыщенных кислот молекулярным кислородом (Кучеренко Н.Е, Васильев А.Н., 1985). Этот показатель является одним из основных факторов, вызывающих повреждение биологических мембран. Оно может быть инициировано целым рядом факторов, в том числе и УФ-облучением (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972; Poste G., 1976; Poste G., 1978). Основными стадиями этого процесса являются: образование гидроперекисей, циклизация и последующее расщепление углеводородных цепей с образованием малонового диальдегида, альдегидов и кислот (Владимиров Ю.А., 1989).

В процессах перекисного окисления липидов активатором молекулярного кислорода являются ионы Fе2+. Комплекс Fе2+–аскорбиновая кислота активирует перекисное окисление липидов во всех типах биологических мембран (Мельянцева Л.П., 1995). Инициировать этот процесс могут также и другие металлы переменной валентности – Cu, Mn, Co, а также соединения, способные образовывать свободные радикалы (Кучеренко Н.Е., Васильев А.Н., 1985).

Свободным радикалом называют часть молекулы, имеющую на внешнем уровне неспаренный электрон. Для устойчивого состояния молекула должна содержать на внешней орбитали два электрона, поэтому свободные радикалы активно стремятся отнять недостающий электрон у других молекул (Удянская И.Л., 2001).

Основной целью нападения свободных радикалов являются фосфолипиды, в состав которых входят жирные ненасыщенные кислоты. При взаимодействии свободных радикалов с молекулой ненасыщенного липида (RН) происходит образование липидных радикалов (R*), которые практически мгновенно реагируют с находящимся в среде окисления кислородом, образуя активные гидроперекисные радикалы (RО2) (Gains N., 1977). Эти радикалы окисляют новые молекулы липидов с образованием липидных гидропероксидов (RООН) и липидных радикалов. Гидропероксиды являются крайне нестойкими соединениями и разлагаются с образованием радикалов RО* (Николаев А.Я., 2001). Процесс разложения гидропероксидов может происходить
как спонтанно, так и с участием ионов железа и меди. Эти радикалы,
в свою очередь, окисляют следующую молекулу липида. В результате количество свободных радикалов растет лавинообразно (Удянская И.Л., 2001):

RН + НО* → Н2 О + R*

R* + О2 → RО2*

RО2* + RН → RООН + R*

RООН → НО* + RО*

RО*+ RН → RОН + R*

Мембраны живых клеток подвергаются окислительному повреждению в результате радикальной атаки. Перекисное окисление липидов – физиологический процесс, а пероксиды – продукты обмена живых клеток, образующиеся на определенном стационарном уровне (Алавердиева С., 1999). Стационарность обеспечивается за счет физико-химической регуляции окислительных реакций, параметрами которой является антиокислительная активность и состав липидов (Senda M.L., 1979). При этом необходимо учитывать, что невозможно изменить какой-либо из параметров системы, не затронув остальные (Аристархов С.А., 1976). В последнее время большое внимание уделяется поиску различных антиоксидантов, особенно из природного сырья, поскольку такие соединения более легко выводятся из организма и являются экологически чистыми (Круглякова К.Е., Шишкина Л.Н., 1992). Внутриклеточная антиоксидантная защита дополняется действием внеклеточных антиоксидантов, которые отвечают за очистку от свободных радикалов в первую очередь внеклеточного пространства. Наиболее важными внеклеточными антиоксидантами являются глутатион, витамины Е, А, С, аскорбилпальмитат, глутатион пероксидаза, супероксоддисмутаза и каталаза (Хертель Б., 2000). В работе [14] показано, что наилучшая эффективность антиоксидантного действия проявляется при совместном введении токоферола (~ 0,2 % от количества жира или лецитина) и аскорбилпальмитата (0,1 %).

Кроме антиоксидантов, целесообразно соблюдать условия хранения липосом, предотвращающие фотоокисление: хранить фосфолипиды и липосомы в темноте или в непрозрачных емкостях и при невысоких температурах (ниже комнатной). При проведении инкапсулирования липосом необходимо использовать только дистиллированную или деминерализованную воду, т.к. попадание ионов металлов, особенно ионов железа, может действовать как катализатор при окислительных повреждениях липосомальных средств. Гидрогенизированные фосфолипиды не содержат двойных связей и, следовательно, не являются предметом окисления. Известны эксперименты, которые показывают, что стабильность липосом из гидрогенизированного лецитина равна стабильности липосом из синтетических материалов (дистеароилфосфатидилхолин) [14]. Также было обнаружено, что в течение периода наблюдения 90 дней существенного количества капсулированного глюкозного маркера из липосомных капсул, сделанных из гидрогенизированного лецитина, не выделялось, в отличие от липосом из негидрогенизированного лецитина, которые теряли глюкозу всего за несколько дней.

Липосомальные препараты, как и все дисперсии на основе масел и жиров, склонны к микробиологической порче. Большинство методов стерилизации и консервирования, принятых в пищевой промышленности (стерильная упаковка, стерилизация после расфасовки, лиофилизация, транспортировка и хранение при низких температурах), не пригодно для косметики. Например, стерильная, асептическая упаковка будет эффективна лишь до момента открытия банки, а стерилизация высокими температурами после расфасовки приведет к разрушению многих биологически активных компонентов. Поэтому надо в их состав включать антимикробные агенты (консерванты). Основной проблемой при подборе консервантов является их агрессивность и токсичность. Поэтому при подборе консервантов необходимо учитывать, что, во-первых, они должны обладать избирательностью, то есть действовать только на бактериальные клетки, во-вторых, их безопасность должна быть хорошо подтверждена, в-третьих, их спектр действия должен быть достаточно широким, и, в-четвертых, они должны быть эффективны в низких концентрациях.

vneshnie-ustrojstva-pk.html
vneshnij-dolg-rossijskoj-federacii-problemi-upravleniya-chast-10.html
vneshnij-dolg-rossijskoj-federacii-problemi-upravleniya-chast-3.html
vneshnij-dolg-rossijskoj-federacii-problemi-upravleniya.html
vneshnij-i-vnutrennij-dolg-rossii-chast-6.html
vneshnij-rossijskij-dolg-struktura-i-dinamika.html
  • textbook.bystrickaya.ru/knigata-i-knizhniyat-pazar-v-digitalnata-epoha.html
  • upbringing.bystrickaya.ru/kontrol-uchebnie-posobiya-po-msfo-million-skachannih-kopij.html
  • tests.bystrickaya.ru/kursovaya-rabota-po-discipline-seti-evm.html
  • reading.bystrickaya.ru/l-b-krasin-pisma-zhene-i-detyam-stranica-7.html
  • writing.bystrickaya.ru/makdonalidizaciya-v-rossii-teoriya-i-praktika.html
  • writing.bystrickaya.ru/ekonomicheskaya-effektivnost-vneshnih-investicij-ekon-effektivnostvn-vneshn-investichii-v-progrechii-azerbaydjanskoy-ekonomiki-v-obraze-grajdanskoy-aviachii-chast-5.html
  • credit.bystrickaya.ru/perspektivi-dlya-rossijskih-chernobilskih-detej-sozdanie-uchebnogo-centra-i-seti.html
  • prepodavatel.bystrickaya.ru/the-economics-of-music-dokladi-zaslushannie-na-plenarnom-zasedanii.html
  • studies.bystrickaya.ru/finansovaya-sistema-sostavlyayushie-i-znacheniya.html
  • laboratornaya.bystrickaya.ru/raspisanie-uchebnih-zanyatij-zachetov-i-ekzamenov.html
  • upbringing.bystrickaya.ru/kusainova-m-a-lichnostno-orientirovannoe-obuchenie-v-shkole-metodologiya-koncepciya-sistema-monografiya-stranica-5.html
  • kontrolnaya.bystrickaya.ru/rabochaya-uchebnaya-programma-disciplini-mikroprocessornie-sistemi-po-specialnosti-23010065-informatika-i-vichislitelnaya-tehnika.html
  • esse.bystrickaya.ru/raspredelenie-chasov-po-temam-kursa-i-vidam-zanyatij-uchebno-metodicheskij-kompleks-po-discipline-istoriya-gosudarstva.html
  • bukva.bystrickaya.ru/pisha-dlya-uma.html
  • knigi.bystrickaya.ru/sostav-sekcii-geografii-federalnogo-ekspertnogo-sostav-sekcii-doshkolnogo-obrazovaniya-federalnogo-ekspertnogo.html
  • znanie.bystrickaya.ru/734-kontrolnie-uprazhneniya-testi-dlya-opredeleniya-teoriya-i-metodika-fizicheskogo-vospitaniya-i-sporta.html
  • institute.bystrickaya.ru/frazeosemanticheskoe-pole-s-komponentom-somatizm-v-anglijskom-i-russkom-yazikah-sopostavitelnij-analiz.html
  • uchitel.bystrickaya.ru/rabochaya-programma-uchebnoj-disciplini-vvedenie-v-specialnost-dlya-podgotovki-bakalavrov-fgos-vpo-3-go-pokoleniya-napravlenie-110500-62-sadovodstvo.html
  • knowledge.bystrickaya.ru/novosti-zhivotnovodcheskih-kompanij-rinok-molochnoj-produkcii-rf-poluchatel.html
  • shkola.bystrickaya.ru/myod-sahar-zameniteli-sahara.html
  • tetrad.bystrickaya.ru/uchebno-metodicheskij-kompleks-di-sciplini-obektno-orientirovannij-analiz-i-programmirovanie-doklad-e-i-zabudskogo-obektno-orientirovannij-analiz-i-programmirovanie.html
  • letter.bystrickaya.ru/nazvanie-visshego-uchebnogo-zavedeniya.html
  • uchitel.bystrickaya.ru/rabochaya-programma-po-discipline-menedzhment-dlya-specialnosti-080503-antikrizisnoe-upravlenie.html
  • pisat.bystrickaya.ru/tema-6--organizaciya-individualnogo-konsultirovaniya-uchebno-metodicheskij-kompleks-po-discipline-dpp-03.html
  • paragraph.bystrickaya.ru/konvertiruemost-plan-seminara-mezhdunarodnoe-razdelenie-faktorov-proizvodstva-mirovoj-rinok-i-mezhdunarodnoe-dvizhenie-tovarov.html
  • doklad.bystrickaya.ru/uchebno-metodicheskij-kompleks-teoriya-gosudarstva-i-prava-visshee-professionalnoe-obrazovanie-specialnost-030501-65-yurisprudenciya-moskva-2011.html
  • gramota.bystrickaya.ru/zadacha-1-stranica-11.html
  • uchitel.bystrickaya.ru/razdel-1-predmet-soglasheniya-normativno-metodologicheskoe-obespechenie-pilotnogo-proekta-po-organizacii-deyatelnosti.html
  • crib.bystrickaya.ru/gosudarstvennie-stroitelnie-normi-ukraini-proektirovanie-dbn-a-2-1-2003.html
  • pisat.bystrickaya.ru/tablica-4-svedeniya-po-kladbisham-v-rf-po-regionam-za-2004-g-mezhdunarodnoj-nauchno-prakticheskoj-konferencii-sovremennie.html
  • uchitel.bystrickaya.ru/rabochaya-programma-po-discipline-opd-f-16-upravlenie-kachestvom.html
  • paragraph.bystrickaya.ru/kriterii.html
  • textbook.bystrickaya.ru/inostrannij-yazik-uchebnij-plan-3-inostrannij-yazik-4-otechestvennaya-istoriya-18.html
  • report.bystrickaya.ru/kak-povisit-pribil-predpriyatiya.html
  • writing.bystrickaya.ru/4-fild-i-ego-znachenie-konspekt-i-voprosi-k-zachyotu-sostavitel.html
  • © bystrickaya.ru
    Мобильный рефератник - для мобильных людей.